Patient & CommunityMedical ExpertUMCers
Booking|Bidding|Contact
Logo
logo pre header
UMC CARE APP
BookingBidding
Tiếng việt
English

Nhuộm miễn dịch huỳnh quang trực tiếp: Kỹ thuật chẩn đoán hiện đại

|
Pathology Department
A23-086
ThS BS.
Nguyễn Hoàng Vinh
Khoa Giải phẫu bệnh
View detail
Tìm hiểu kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (DIF), nguyên lý, quy trình, ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh tự miễn về da, bệnh thận và tác nhân nhiễm trùng, cùng ưu nhược điểm của phương pháp hiện đại này.

1. Giới thiệu về Nhuộm miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (DIF)

1.1. DIF là gì?

Nhuộm miễn dịch huỳnh quang (Immunofluorescence - IF) là một kỹ thuật miễn dịch hóa học quan trọng cho phép phát hiện và định vị nhiều loại kháng nguyên trong các loại mô và tế bào khác nhau [1]. DIF là một quy trình một bước để xác định các kháng thể gắn in vivo vào kháng nguyên trong mô, sử dụng một kháng thể duy nhất được gắn huỳnh quang để nhuộm mô hoặc tế bào [3, 4]. Kháng thể này nhận diện và liên kết với phân tử mục tiêu.

1.2. Lịch sử hình thành và phát triển

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang được mô tả lần đầu tiên vào năm 1942 và được hoàn thiện bởi Coons vào năm 1950 [3]. Ứng dụng của nó trong da liễu học bắt đầu vào năm 1963, khi kỹ thuật này được sử dụng để phát hiện sự lắng đọng của globulin miễn dịch và bổ thể tại ranh giới biểu bì-hạ bì trong bệnh lupus ban đỏ hệ thống ("lupus band test") [2]. Một năm sau, vào năm 1964, Beutner và Jordon đã sử dụng kỹ thuật IF gián tiếp (IIF) để phát hiện thành công các kháng thể lưu hành trong huyết thanh của bệnh nhân Pemphigus [2, 3]. Kể từ đó, DIF đã được sử dụng rộng rãi để hiểu và phân loại các rối loạn mà cơ chế miễn dịch đóng vai trò quan trọng [2].

1.3. Vai trò trong chẩn đoán y học

DIF là một xét nghiệm chẩn đoán quan trọng để đánh giá các rối loạn bóng nước, viêm mạch [4] và bệnh mô liên kết [4]. Đây là một kỹ thuật mạnh mẽ và thiết thực, cung cấp thông tin chẩn đoán có giá trị cao cho nhiều bệnh da liễu nghiêm trọng [4]. Các nhà bệnh học da liễu phụ thuộc rất nhiều vào dữ liệu thu được từ đánh giá DIF để xác nhận chẩn đoán cuối cùng [4].

2. Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật DIF

2.1. Phản ứng kháng nguyên - kháng thể

Kỹ thuật IF liên quan đến việc quan sát các phức hợp kháng nguyên-kháng thể dưới kính hiển vi tử ngoại, sử dụng các kháng thể tương ứng được gắn với một chất huỳnh quang [2]. Trong DIF, một kháng thể sơ cấp được gắn trực tiếp với một chất huỳnh quang sẽ phản ứng với kháng nguyên mục tiêu [1]. Kháng thể này sẽ liên kết đặc hiệu với kháng nguyên có mặt trong mẫu bệnh phẩm.

2.2. Fluorochrome và cơ chế phát huỳnh quang

Fluorochrome là các hợp chất chứa các electron mà khi được chiếu xạ bằng ánh sáng có bước sóng cụ thể, chúng sẽ đạt đến trạng thái năng lượng cao hơn không ổn định. Khi quay trở lại trạng thái cơ bản thông qua quá trình tự phát, chúng phát ra ánh sáng có bước sóng dài hơn [2]. Để hoạt động như các chất đánh dấu, chúng phải có các nhóm hóa học có khả năng hình thành liên kết cộng hóa trị với các phân tử protein, phát ra huỳnh quang cao trong phổ nhìn thấy [2]. Các chất huỳnh quang được sử dụng phổ biến nhất là fluorescein isothiocyanate (FITC) tạo ra màu xanh lá cây táo và tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) tạo ra màu đỏ huỳnh quang [2].

2.3. Sự khác biệt giữa DIF trực tiếp và gián tiếp

Có hai phương pháp IF chính: trực tiếp (Direct IF - DIF) và gián tiếp (Indirect IF - IIF) [1, 2].

  • DIF (trực tiếp): Đây là một quy trình một bước, trong đó kháng thể sơ cấp được gắn trực tiếp với chất huỳnh quang liên kết với kháng nguyên đích [1, 3]. Phương pháp này nhanh hơn [1].

  • IIF (gián tiếp): Phương pháp này bao gồm quy trình ủ hai bước: 1) kháng thể sơ cấp không được đánh dấu liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đích, 2) kháng thể thứ cấp được gắn huỳnh quang nhận diện và liên kết với kháng thể sơ cấp [1, 3]. Mặc dù phương pháp trực tiếp nhanh hơn, phương pháp gián tiếp được sử dụng rộng rãi hơn vì độ nhạy cao, khả năng khuếch đại tín hiệu và khả năng phát hiện nhiều mục tiêu trong cùng một mẫu [1].

3. Quy trình thực hiện kỹ thuật DIF

3.1. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

Việc chuẩn bị mẫu bệnh phẩm đúng cách là rất quan trọng để đảm bảo kết quả chính xác.

  • Sinh thiết da: Đối với hầu hết các bệnh tự miễn bóng nước, một mẫu sinh thiết bấm 3-4 mm là tối ưu [2]. Điều quan trọng là phải lấy mẫu sinh thiết từ vị trí thích hợp để có được kết quả tối đa. Vị trí sinh thiết lý tưởng trong tất cả các bệnh tự miễn bóng nước là vùng da quanh tổn thương (perilesional skin) [2, 4]. Nên tránh vùng da tổn thương hoàn toàn hoặc vùng da lành xa [4].

  • Mẫu niêm mạc miệng: Cần xử lý mẫu nhẹ nhàng vì mô niêm mạc dễ bị tổn thương do đè ép [4].

  • Vận chuyển: Mẫu sinh thiết da nên được vận chuyển đến phòng thí nghiệm trong dung dịch muối đệm phosphat (PBS) [2]. Nếu không có sẵn cơ sở IF tại địa phương, mẫu sinh thiết có thể được vận chuyển đến trung tâm xét nghiệm trong môi trường Michel [2]. Môi trường vận chuyển Michel có pH trung tính và chứa amoni sulfat là môi trường ưu tiên cho sinh thiết DIF [4].

3.2. Cố định và xử lý mẫu

Cố định là một bước sơ bộ thiết yếu trong nhuộm IF để ngăn ngừa tự phân hủy, giảm thiểu thối rữa và bảo tồn hình thái đồng thời duy trì tính kháng nguyên [1]. Phương pháp cố định lý tưởng là cố định kháng nguyên mục tiêu mà không làm xáo trộn cấu trúc tế bào để kháng thể có thể tiếp cận tối đa các thành phần tế bào mục tiêu [1].

3.3. Quy trình nhuộm và ủ kháng thể

Sau khi cố định và phục hồi kháng nguyên, một trong hai phương pháp IF có thể được sử dụng: DIF hoặc IIF [1]. Trong phương pháp trực tiếp, chất huỳnh quang được liên kết trực tiếp với kháng thể sơ cấp sẽ phản ứng với kháng nguyên đích [1]. Sau khi ủ kháng thể, mẫu sẽ được rửa sạch để loại bỏ các kháng thể không liên kết [1].

3.4. Quan sát và đọc kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang

Các kháng thể được gắn huỳnh quang sẽ phát ra ánh sáng khi được kích thích bằng ánh sáng có bước sóng ngắn hơn [1]. Các mẫu được kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang ở bước sóng kích thích phù hợp của chất huỳnh quang [1]. Để có kết quả tốt nhất, nên kiểm tra mẫu ngay lập tức [1]. Các phiến kính nên được bảo quản phẳng ở 4°C, tránh ánh sáng [1].

4. Ứng dụng lâm sàng của DIF trong y học

4.1. Chẩn đoán các bệnh tự miễn về da (ví dụ: Pemphigus, Pemphigoid)

DIF là một công cụ chẩn đoán quan trọng cho các bệnh tự miễn bóng nước (VBD) [4].

  • Pemphigus: DIF có độ nhạy từ 90%–100% ở những bệnh nhân mắc bệnh hoạt động [2]. Các tự kháng thể trong pemphigus hướng đến các protein desmosome, cụ thể là desmoglein 1 và 3 (Dsg 1 và 3), chịu trách nhiệm cho sự kết dính tế bào-tế bào trong biểu bì [2].

  • Pemphigoid bóng nước (BP): DIF là xét nghiệm chẩn đoán quan trọng [4].

  • Viêm da dạng herpes (DH): Kết quả DIF rất quan trọng trong chẩn đoán viêm da dạng herpes [4].

  • Các bệnh tự miễn da khác: DIF cũng được sử dụng trong chẩn đoán các bệnh như lupus ban đỏ hệ thống (SLE), viêm mạch và các bệnh mô liên kết [2, 4].

4.2. Chẩn đoán các bệnh lý thận (ví dụ: bệnh cầu thận)

DIF cũng được sử dụng để phát hiện sự lắng đọng phức hợp miễn dịch trong các bệnh lý cầu thận, cung cấp thông tin quan trọng cho việc phân loại và định hướng điều trị.

4.3. Phát hiện tác nhân gây nhiễm trùng

Mặc dù không phải là ứng dụng chính của DIF, nhưng kỹ thuật IF nói chung đã được Coons áp dụng lần đầu tiên vào những năm 1940 để chứng minh vi sinh vật trong mô bị nhiễm bệnh [2].

5. Ưu điểm và nhược điểm của DIF

5.1. Ưu điểm (độ nhạy, độ đặc hiệu, tốc độ)

  • Độ nhạy và đặc hiệu cao: DIF cho phép độ nhạy và khuếch đại tín hiệu tuyệt vời so với hóa mô miễn dịch [1].

  • Nhanh chóng: Phương pháp trực tiếp nhanh hơn [1].

  • Chẩn đoán chính xác: Cung cấp thông tin chẩn đoán cần thiết cho nhiều bệnh da liễu nghiêm trọng [4].

5.2. Nhược điểm (yêu cầu thiết bị, kỹ năng, hạn chế photobleaching)

  • Yêu cầu thiết bị chuyên dụng: Cần kính hiển vi huỳnh quang và các thiết bị khác [1].

  • Yêu cầu kỹ năng người thực hiện: Việc đọc và diễn giải kết quả đòi hỏi kinh nghiệm [4].

  • Photobleaching: Các chất huỳnh quang dễ bị photobleaching (mất màu do ánh sáng) [1]. Để giảm thiểu photobleaching, có thể chọn các chất huỳnh quang ổn định với ánh sáng, giảm thời gian và cường độ kích thích, và sử dụng thuốc gắn chống phai màu [1].

  • Kết quả âm tính giả/dương tính giả: Có thể xảy ra do các yếu tố kỹ thuật như nhiễm formalin mẫu bệnh phẩm, môi trường vận chuyển không đúng, hoặc chậm trễ trong xử lý mẫu [2, 4].

6. Khi nào cần thực hiện xét nghiệm DIF?

DIF là xét nghiệm chẩn đoán được chỉ định khi có nghi ngờ lâm sàng cao về các bệnh tự miễn bóng nước [4], viêm mạch [4] hoặc bệnh mô liên kết [4]. Việc lựa chọn vị trí sinh thiết tối ưu là rất quan trọng để tối đa hóa độ chính xác chẩn đoán [4].

7. Tài liệu tham khảo

Tags:
Bệnh tự miễnNhuộm miễn dịch huỳnh quangKỹ thuật chẩn đoánKháng nguyên
Share

Related Posts